Daun pegagan (Centella asiatica L.) merupakan tanaman herbal yang telah lama dikenal memiliki kandungan senyawa bioaktif dengan potensi antimikroba. Penelitian ini bertujuan untuk mendeskripsikan karakteristik morfologi bakteri endofit daun pegagan (Centella asiatica L.) dan menguji kemampuan daya hambatnya terhadap Escherichia coli, serta Untuk menganalisis hasil uji kelayakan terhadap modul perkuliahan mikrobiologi sebagai output penelitian pada materi antimikroba bab daya hambat.Tahapan penelitian meliputi isolasi bakteri endofit dari daun pegagan menggunakan metode kultur. Isolat yang diperoleh diidentifikasi secara awal melalui karakterisasi morfologi koloni,pewarnaan gram, dan pengamatan mikroskopis. Uji daya hambat dilakukan menggunakan difusi sumuran. Metode analisis penelitian menggunakan uji statistika menggunakan software SPSS Versi 25 dengan uji one way ANOVA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari daun pegagan berhasil diisolasi jenis bakteri endofit sebanyak 12 isolat dengan karakteristik morfologi yang bervariasi,dari uji daya hambat ditemukan bahwa zona hambat terbesar terdapat pada kontrol positif (>30mm) ciprofloksasin yang memiliki rata-rata tertinggi disekitar 41.83mm, zona hambat sedang (10-30mm) terdapat pada isolat D1, D2, BT1, BT2, dan BT3. Sedangkan zona hambat yang paling lemah (≤10mm) yaitu terdapat pada isolat seperti K-, A1, A2,D3, dan A5. Berdasarkan hasil dari uji data one way ANOVA dapat disimpulkan bahwa tidak ada perbedaan secara signifikan antar populasi. Masing-masing isolat bakteri endofit daun pegagan menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata dengan isolat lainnya. Gabungan nilai hasil dari dua validator uji kelayakan materi dan media menghasilkan nilai total keseluruhan yaitu dengan persentase 76,4% dengan kategori layak sebagai modul pembelajaran serta dapat direkomendasikan sebagai salah satu referensi sumber pembelajaran mata kuliah Mikrobiologi.

kata kunci : Centella asiatica L. Bakteri Endofit, Escherichia coli, Uji Daya Hambat, Mikrobiologi.