Roti merupakan salah satu makanan yang bisa dikonsumsi sehari-hari. Roti terbuat dari bahan tepung yang menyebabkan roti tersebut mudah terkontaminan oleh mikroba. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian untuk mengetahui bagaimana karakteristik jamur roti makroskopis dan mikroskopis sebelum dan sesudah masa kadaluarsa. Penelitian ini dilakukan di kawasan Kopelma Darussalam Banda Aceh dengan pengambilan sampel di beberapa titik dan dilakukan pengujian di Laboratorium Pendidikan Biologi UIN Ar Raniry Banda Aceh. Tujuan penelitian ini untuk mengidentifikasi, menganalisis karakteristik jamur roti sebelum dan sesudah masa kadaluarsa yang terdapat dibeberapa titik kawasan Kopelma Darussalam Banda Aceh dan mengkaji hasil kelayakan output yang dihasilkan dari penelitian ini sebagai referensi Praktikum Mikologi pada materi “Jamur Kontaminasi Pada Roti”. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah deskriptif dengan teknik porposive sampling. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini roti yang sebelum dan sesudah kadaluarsa di kawasan Kopelma Darussalam Banda Aceh. Analisis data jenis dan karakteristik jamur dilakukan secara deskriptif sedangkan uji kelayakan output menggunakan rumus persentase. Hasil penelitian diketahui bahwa spesies jamur yang ditemukan pada roti sebelum dan sesudah masa kadaluarsa di kawasan Kopelma Darussalam Banda Aceh berjumlah 3 spesies yaitu, Aspergillus niger, Aspergillus flavus dan Aspergillus fugimatus. Karakteristik spesies jamur yang dibedakan berdasarkan karakteristik mikroskopis yaitu warna koloni, bentuk konidia, bentuk vesikula, bentuk konidiofor, warna konidiofor dan struktur hifa. Sedangkan karakteristik pada makroskopis warna koloni, permukaan koloni, garis radial dan lingkaran kosentris. Hasil uji kelayakan output modul yang telah di tentukan oleh validator ahli media memperoleh nilai 87% dengan kategori sangat layak digunakan dan validator ahli materi memperoleh nilai 86% dengan kategori sangat layak digunakan.